呼吸链电子漏旁路的发现及其医学应用价值

聚焦呼吸链 攻研电子漏旁路

自然界进化出了两种至关重要的生物能量转化器,一个是植物叶绿体里的光合链,另一个是动物线粒体里的呼吸链。光合链是光合作用中的能量转换器,光合作用是在光的驱动下通过把CO2和H2O合成为碳水化合物的方式把太阳能固化到果食中。呼吸链是生物氧化作用中的能量转换器,它位于线粒体的内膜上,其功能是把固化在果食中的太阳能通过生物氧化作用制造成ATP, ATP是一种能量载体分子,源源不断的ATP供应为推动细胞的各种生命活动提供能量。我们实验室用了"生命引擎”这一热力学概念描述呼吸链的功能,就像热机燃烧石油煤炭是把固化在油和煤炭中的古代太阳能转化为推动汽车飞机运行的动力。呼吸链就是推动细胞生命活动的“生命引擎”。一个细胞内含有很多的线粒体,每个“线粒体”内又有很多很多的呼吸链,如此构成庞大的“生命引擎”群驱动着机体细胞的各种生命活动。使肌肉能收缩,神经能传导、大脑能学习记忆和思考、细胞能自我繁殖和更新,组织能自我修复损伤以保证器官功能的正常发挥等等。

我是中国科学技术大学生物物理系首届毕业生,1963毕业实习时一个偶然的机会被邹承鲁院士引进了呼吸链的结构与功能研究,从此呼吸链成为了我一生的探索追求。

国际学术界对呼吸链结构与功能的研究已经有一百多年的历史了,发现呼吸链的科学家是英国剑桥大学的Keillin教授,他是与居里夫人同时代的科学家。居里夫人用光谱分析手段发现了一种新的放射性元素U235,填补了元素周期表的一个空缺,开辟了放射化学学科领域,荣获了两次诺贝尔奖。Keillin教授用同样的光谱分析方法发现了三个与细胞呼吸相关的物质,命名为细胞色素a,细胞色素b,和细胞色素c,细胞色素链就是呼吸链的主体成员,开辟了生物能量学新学科。但是,由于生物学远远比化学复杂,Keillin教授没有居里夫人那么幸运,把获奖的机会留给了后来的生物能量学家。

呼吸链是怎样的物质结构?如何参与制造ATP?这是生物能量学家探讨的焦点科学问题,我国的生物能量学家为此做出过赞不绝口的重要贡献。剑桥有三位中国留学生王应睐,邹承鲁和曹天庆,他们于建国初期回到上海创建了从分子水平探讨生命科学的上海生物化学研究所。王应睐在剑桥读博时就发现除了细胞色素之外还有一种黄素蛋白参与细胞呼吸,邹承鲁在剑桥读博时就用科学实验证明了细胞色素c在呼吸链中传递转移电子的功能。在上海生化所他们合作很快就完成了琥珀酸脱氢酶(王应睐发现的黄素蛋白)的纯化及其与细胞色素链的功能组合,这就确定了完整呼吸链的结构基础,为呼吸链功能的深入研究铺平了道路。1961年英国科学家Mitchel提出了化学渗透学说解释呼吸链制造ATP的分子机制,在争论了十多年后于1978年获得了诺贝尔奖。但是Mitchel理论与实验检测之间存在偏差的问题并没有因为获奖而终止争论。根据热力学原理任何热机在做"有用功"时都伴有克服磨擦损伤而出现“无用功”,从生物物理学的观点分析Mitchel理论与实验检测之间的偏差会不会与呼吸链做“无用功”有关呢?换句话说“引擎”的磨损会导致机器的老化报废,那么"生命引擎"也会磨损吗?“生命引擎”的磨损是否引起衰老和死亡?为了回答这个猜想,我们课题组做了大量的实验研究和很长时间的理论思考,最终我们重新演绎了邹承鲁早年论证细胞色素c电子传递功能的实验发现了呼吸链的电子漏旁路(如下面图1和图2所示)

图1:超氧自由基O2-.的生成与重组细胞色素c的计量关系

图中横坐标是重组细胞色素c的剂量,纵坐标是检测重组合的效果。向上弯曲增长的曲线就是邹承鲁当年读博时在Keillin 实验室做出的证明细胞色素c在呼吸链中传递电子功能的实验曲线。向下弯曲递减的曲线是我们在北京测定的呼吸链漏电子产生超氧自由基(O₂⁻˙)的实验曲线,两条曲线的测定竟相隔了半个世纪的时差,这是因为在这半个多世纪的时间里自由基生物学有了很大的发展,这是使我们想到要重新启用当年邹承鲁做过的实验设计完成我们新的实验目的的原因。邹承鲁设计的实验相当精彩,他成功的关键是他发现了一个把细胞色素c从吸链制剂抽取出来而得到了一个没有活性的呼吸链制剂,然后他把提纯的细胞色素c 重新组合到因缺少细胞色素c而没有活性表现的呼吸链制剂中,得到了把呼吸链活性恢复出来的实验结果。这是首次用科学实验证明了细胞色素是一种氧化还原酶,呼吸链就是一组按照氧化还原电位高低有序排列的电子传递链,细胞色素c就是通过自身氧化状态和还原状态的反复反转起到转移传递电子的功能,因此邹承鲁很年轻的时候就成为了世界级的生物能量学家。我们重演当年邹承鲁实验的想法是因为当年邹承鲁检测呼吸链活性的指标是消耗氧气的能力,而我们的想法是检测呼吸链制剂会不会产生超氧自由基(O2-.)和双氧水(H2 O2)。测超氧自由基O2-.的原因是受到自由基生物学的启发,超氧自由基O2-.是衍生出一系列含有活泼氧原子而具有强氧化损伤性毒害的活性氧自由基的源头。测H2O2的原因是Keillin实验室一直有一个未解决的遗留问题,就是线粒体不仅制造ATP还产生双氧水(H2O2),但双氧水是怎样生成的?这个问题一直没有解决。

如果对图1的两条曲线做一个数学处理,把两条曲线的拐点纵向链接起来,我们得到了三个区域划分的结果(如图1色彩所示)。三个区域划分的结果给了我们很大的思想启发:右边粉色区显然应当是正常生理状态区,这里呼吸链传递电子还原氧的活性很高,漏电子产生超氧自由基(O₂⁻.)的数量很少。左边蓝色区是不可逆的死亡区,这里漏电子产生超氧自由基(O₂⁻.)随细胞色素c重组剂量的减少而迅速升高,电子传递还原氧的活性迅速下降。中间黄色区是过渡期,显示生理状态可以变好也可以变坏。三个区域划分的结果激发了我们做动物模型实验的兴趣,我们发现随着小鼠年龄的老化呼吸链电子漏产生超氧自由基的水平也在增加;运动疲劳小鼠的呼吸链漏电子产生超氧自由基的水平比不运动的对照小鼠高;甲亢小鼠呼吸链漏电子产生超氧自由基的水平高于正常对照小鼠,而且有计量相关性;缺血再灌流实验证明再灌流时呼吸链电子漏产生超氧自由基的水平会增高;大量的动物模型实验都显示了呼吸链电子漏产生超氧自由基的水平与动物的生理状态有相关性,因此探讨呼吸链漏电子与疾病的关系成为了我们新的研究方向。

如果把呼吸链看作是分子热机,电子传递制造ATP视为“有用功”,电子漏产生超氧自由基引起氧化损伤导致疾病和衰老视为“无用功”,那么用热力学的热机原理探讨生命就有了可靠的科学实验依据。

线粒体是自然界细胞进化过程中从单细胞生物进化出多细胞生命体的分水岭,没有线粒体的细胞都是原始的单细胞生物,有了线粒体之后才进化出多细胞生命体。低等多细胞生物体显示出每个物种的细胞数目都是确定的(细胞的定数规律),而且细胞不是胡乱堆积在一起而是排列有序的。这可从损伤部位的修复再生过程明显看出,例如壁虎的尾巴掉了之后会再生出一个新尾巴和原来尾巴的大小一样;蜈蚣被切成两段,每段都会再生出其缺少部分的细胞数目而成为两个新蜈蚣。线粒体是怎样参与构建细胞有序性结构和维持细胞有序性结构的?这是一个生命科学的重大研究课题。细胞的有序性正是体现在中医经络系统中的物质基础,维护细胞的有序性结构就是人体自愈能力的本质,而中医理论的精髓就是调动人体的自愈能力,修复损伤恢复健康,从这个角度看,中医是一种实实在在的科学。

下面图2是我们根据多年实验研究和国际文献资料总结出来的电子漏旁路图,四条电子漏旁路造成的非磷酸化呼吸正是Mitchell理论讲的磷酸化呼吸与实验检验存在的偏差。

图2:呼吸链电子漏旁路示意图

图中蓝色椭圆表示参与线粒体氧化磷酸化制造ATP的酶,黄色表示描述氧化磷酸化机制的Mitchell理论,(该理论1961年提出,1978年获得诺贝尔奖)。绿色箭头表示电子在呼吸链中传递的方向,O₂被末端氧化酶(细胞色素a )抓住直至接受4个电子变成H₂O才被释放出去。红色箭头表示本实验室论证的呼吸链电子漏旁路。

显然电子漏旁路中 产生了O₂⁻˙,它是多种含有活泼氧原子的氧毒性物质产生的源头, 氧毒性物质极易引起氧化损伤导致疾病和衰老。但现实表明它们有更重要的作为生物信号启动人体抗氧化免疫机制和损伤修复机制的作用,这正是探讨健康长寿问题的新课题。

我们可以把呼吸链看做是分子热机,电子传递制造ATP视为“有用功”,电子漏产生有害氧自由基视为“无用功”,用热力学的热机原理探讨生命。也可以把呼吸链看做是阴阳元素,视ATP合成为“阳”,视漏电产生氧自由基为“阴”,用阴阳平衡探讨医学理论。

上述图1细胞色素c 重组活性的实验曲线显示出细胞色素c的两难困境,细胞色素c的主要功能是传递电子制造ATP, 但是一旦呼吸链受损就会持续漏电子产生有害的氧自由基,细胞色素c又肩负着清除氧自由基的功能。所以,一旦呼吸链受损持续漏电,细胞色素c的两难处境会迫使细胞色素c漏出线粒体进入细胞浆,而漏出线粒体的细胞色素c进入细胞浆后就会启动细胞凋亡机制清除坏死细胞和促进新生细胞的再生,这表明线粒体呼吸链具有起动修复组织损伤的功能。这方面的研究已经成为了一个科研领域。

图2呼吸链电子漏旁路图也显示了线粒体呼吸链在构建细胞有序性结构和维护细胞有序性功能的原理:一旦线粒体产生NO,NO首先会抑制细胞色素a的氧化作用而诱发电子漏爆发产生大量的NO,大量的NO将通过漏电旁路跨膜转移进入受伤的组织起到修复损伤的功能,这方面的研究还很少,但图2已经显示了这种机制的存在。

未来,我将致力于探索论证中医理论的研究。(作者:徐建兴,系中科院生物物理所研究员)